Генная инженерия

В начале 50-х годов известный вирусолог Сальвадор Лурия столкнулся с интересным явлением: фаги, выращиваемые на одном штамме бактерий, не развивались на другом. Было установлено, что причины этого не в генетическом различии фагов. Осталось исследовать возможность того, не принимают ли их бактерии различным образом. За этим, несомненно, стоял какой-то ферментативный процесс, но его сущность оставалась неясной до 1962 г., когда данным вопросом занялся Вернер Арбер из Биологического центра Базельского университета.

Вместе со своими сотрудниками он исследовал и сформулировал принципы так называемой штаммоспецифичной рестрикции и модификации ДНК. Оказалось, что при вхождении вируса в бактерию на него действует ферментативный аппарат, связанный с бактериальной ДНК (генным комплексом). Специальные ферменты (рестриктазы) атакуют и разрывают вирусную ДНК, ограничивая таким образом ее размножение и функционирование. В этом и состоит суть рестрикции. Дальнейшие исследования показали, что рестриктазы «распознают» определенные участки ДНК и прикрепляются к ним, чтобы разорвать цепь.

Рестрикция оказалась эффективным средством обезвреживания бактериофагов. Она позволяет, однако, уничтожать только некоторые разновидности фагов. Отдельные фаги приспосабливаются к определенным штаммам бактерий и обходят этот механизм, благодаря чему они существуют и размножаются. Арбер открыл возможные пути преодоления рестрикции. Он установил, что в бактерии имеется и другой фермент, который модифицирует химически определенный участок ДНК, подавляя действие рестриктаз. Результаты швейцарского ученого в принципе имели важное значение, но казались далекими от практического применения. Открытые им «молекулярные ножницы» разрывали цепь ДНК неспецифичио, так что не возникало возможности изолировать определенный участок. Ферменты прикреплялись в одном месте цепи ДНК, а разрывали ее в другом.

После Арбера этой новой, интригующей областью молекулярной генетики и энзимологии заинтересовались, многие ученые. Подобные ферменты были обнаружены и в других микроорганизмах. В 1970 г. Гамильтон Смит из университета Джона Гопкинса в Балтиморе обнаружил, что рестриктаза микроорганизмов одного вида у другого вида микроорганизмов разрывает ДНК. точно в том месте, где фермент прикрепляется. Это удачное открытие вызвало взрыв активности среди ученых. К 1975г. различным группам исследователей, удалось выделить, свыше 50 рестриктаз, а сегодня, их получены уже сотни. Все они распознают и отрывают от ДНК участок, состоящий из 4—6 пар нуклеотидов. Многие рестриктазы дают возможность разрывать ДНК в разных точках и: разделять ее на различные фрагменты, содержащие определенные гены. Эти ферменты использовались не только для выделения генов, но и для составления генных карт. Такая работа была проведена в. 1971 г. Даниэлем Натансом.

Этот ученый в течение многих лет исследовал на обезьянах, один из вирусов и с помощью рестриктаз установил конкретно последовательность, действия различных генов; в конечном счете, он разобрался и в системе упорядоченности всех 5 тысяч пар нуклеотидов в. двойной спирала ДНК вируса. Это было достигнуто: с помощью 14 рестриктаз. (Для сравнения можно сказать, что ДНК человека и других высших животных имеет, по всей вероятности, свыше миллиона нуклеотидов.)

В 1972 г. Даниэль Натане стал директором, отдела микробиологии медицинского факультета университета Джона. Гопкинса, где. работал ассистентом Гамильтон Смит. Вместе со своими сотрудниками Натане разработал эффективный метод выделения в чистом виде фрагментов ДНК с помощью, электрофореза. Таким, образом, ученые уже имели «молекулярные ножницы», вырезающие нужные фрагменты из ДНК, и владели методами выделения этих фрагментов. Осталось найти «транспортное, средство», которое позволило бы вводить выделенные гены в клетку.

Такие механизмы, в сущности, были давно известны ученым. Еще в 40—50-х годах, когда закладывались основы бактериальной генетики, было открыто явление трансдукции (переноса генов из одной клетки в другую с помощью вируса). Ген прикрепляется к ДНК вируса, которая впоследствии становится частью хромосомы бактерии. Разумеется, этот механизм действовал лишь у вирусов, которые не уничтожают клетку сразу. Другой механизм связан с процессом полового размножения бактерий. Клетки нормально обмениваются генетическим материалом с помощью плазмид (небольших частиц, содержащих фрагменты ДНК). Если ввести в плазмиды какой-либо ген, то они превращаются в отличное «транспортное средство», переносящее ген в бактерии.

Создание и развитие генной инженерии, как и любой новой области науки, было результатом деятельности большого числа ученых и групп исследователей. Но всегда среди многих можно выделить лиц, внесших решающий вклад. Вернер Арбер открыл рестриктазы, Гамильтон Смит выделил первые рестриктазы, а Даниэль Натане создал метод выделения генов и провел с помощью рестриктаз полное исследование вирусного генома. За свои замечательные научные достижения трое названных исследователей были удостоены в 1978 г. Нобелевской премии по физиологии и медицине.

В числе основоположников генной инженерии стоит и имя Пола Берга из Станфордского университета. В 1972 г. путем химического воздействия он сумел соединить ДНК двух вирусов, получив молекулярный гибрид. Эта методика оказалась очень полезной, так как дала возможность присоединять различные гены к вирусу, используя его как транспортное средство для проникновения в клетку. Таким образом, возникли предпосылки для создания генных «библиотек». Гены, выделенные из самых различных организмов, могут вводиться в клетки бактерий с помощью фагов или плазмид и размножаться вместе с бактериями. Эти бактерии служат фондом генной «библиотеки», и при необходимости из них всегда можно извлечь ген, представляющий интерес для исследователя. Кроме того, гены, перенесенные в необычную среду, начинают действовать по-иному, и это создает возможность для изучения механизма их регуляции.

Важной проблемой в молекулярной биологии является определение нуклеотидной последовательности в ДНК. Больших успехов в этой области добился Фредерик Сенгер, опытный экспериментатор, который в середине 50-х годов разработал метод определения аминокислотной последовательности белков и в 1958 г. получил Нобелевскую премию по химии за определение структуры инсулина.

В 1965 г. Сенгер начинает в Кембридже (где он постоянно работал) исследование структуры нуклеиновых кислот, в частности первичной структуры (нуклеотидной последовательности). С этой целью использовались меченые атомы, что позволило работать с ничтожно малым количеством экспериментального материала — порядка микрограммов. Исследовалась реакция синтезирования второй комплементарной цепи, меченной радиоактивным фосфором, на матрице однониточной ДНК. Она осуществлялась в ходе четырех параллельно идущих опытов, в которых у каждого нуклеотида прерывался рост цепи. Полученные фрагменты ДНК разделяются с помощью электрофореза, что дает возможность точно определить длину конечного полинуклеотида. В каждом из четырех опытов реакция останавливалась соответственно на аденине, гуанине, цитозине и тимине. Зная фрагменты и число нуклеотидов в них, можно точно определить место каждого из этих оснований в молекуле ДНК.

Этот метод Сенгер с сотрудниками применили в 1977 г. для определения положения 16 500 нуклеотидов в ДНК митохондрий человека. Эти клеточные субстанции, генераторы энергии клетки, имеют собственную ДНК и относительную автономию. Предполагается, что они, как и хлоропласта, произошли от симбиотических микроорганизмов, приспособившихся к жизни в клетке. В группе, руководимой Сенгером, были разработаны и другие методы исследования нуклеиновых кислот, с помощью которых еще в 1967 г. удалось определить нуклеотидную последовательность одного из видов РНК, состоящей из 120 нуклеотидов, а в 1977 г. на двух страницах английского журнала Nature был напечатан петитом список всех 5375 нуклеотидов ДНК фага ФХ174: химическая формула бактериофага.

В 1977 г. Уолтер Гилберт из Гарвардского университета предложил новый метод определения места нуклеотидов, основанный на разрыве ДНК по определенному нуклеотиду. Начало этому методу было положено еще в 1966 г. совместной статьей Гилберта, его сотрудника Э. Максама и советского ученого А.Д. Мирзабекова[28]. Советские ученые внесли значительный вклад в развитие этой методики. А.Д. Мирзабеков, А.М. Колчинский и А.Ф. Мельникова предложили метилировать аденин и гуанин, после чего разрывать ДНК, используя реакции с метилированными соединениями. Гилберт и Максам развили метод и открыли отдельные реакции, которые разрывают ДНК в определенных местах у каждого из четырех оснований. При этом получаются фрагменты, которые исследуются также методом электрофореза.

Предварительным этапом в определении нуклеотидной последовательности является разрезание ДНК с помощью рестриктаз. Образующиеся фрагменты состоят из нескольких тысяч нуклеотидов, которые, в сущности, представляют собой отдельные гены. Так, шаг за шагом раскрывается молекулярная структура ДНК бактерий, растений и животных. Со временем, вероятно, будет определена и нуклеотидная последовательность ДНК человека, для записи которой потребуется, по-видимому, несколько томов. Тогда, быть может, и претворятся в жизнь слова Винера о «передаче человека по телеграфу».

Современные научные исследования — это, как правило, плод коллективного труда. Нобелевская премия, однако, индивидуальна, и ею награждаются лишь главные участники и вдохновители исследований. Пол Берг, Фредерик Сенгер[29] и Уолтер Гилберт были удостоены Нобелевской премии по химии в 1980 г., и это символизировало признание крупных успехов, достигнутых многими учеными в области генной инженерии и молекулярной генетики.

В начале 1981 г. процесс выделения генов и получения из них различных цепей был автоматизирован. Генная инженерия в сочетании с микроэлектроникой предвещает чудо XXI в., когда человек, вероятно, научится управлять живой материей так же, как сегодня он управляет неживой. Дорогу к этому прокладывают современные опыты по молекулярной рекомбинации ДНК, которые позволяют получать невиданные гибриды и самые неожиданные сочетания генов.

Важные уточнения, касающиеся строения генома, были сделаны американским генетиком Барбарой Макклинток, которая с 1942 г. работает в известной лаборатории Колд Спринг Хабор.

Вся научная деятельность этой исследовательницы связана с генетикой кукурузы. (Следует заметить, что для генетиков это растение является таким же классическим объектом исследования, как и дрозофила.) Барбара Макклинток пыталась выяснить, чем объясняется различный цвет зерен кукурузного початка. После сложных генетических анализов она пришла к выводу, что геном кукурузы содержит подвижный ген — когда он «прыгает» на другое место, подавленный ген, регулирующий окраску, проявляет свое действие, и зерно окрашивается.

Сообщение о том, что в геноме организма имеются элементы с непостоянным местом, вызвало определенный интерес в научных кругах, но в целом специалисты не обратили на него особого внимания. Однако в середине 70-х годов транспозоны были заново открыты — теперь уже методами молекулярной генетики — советским ученым Г.П. Георгиевым[30]. Вскоре экспериментаторы научились выделять подвижные гены «ин витро». Можно сказать, что генетики действительно находятся на пути к «конструированию» живых существ. И начало этой новой области науки было положено более чем 30 лет тому назад на опытном поле Барбары Макклинток, где она выращивала кукурузу. За открытие подвижных элементов генома Б. Макклинток была удостоена в 1983 г. Нобелевской премии по медицине и физиологии.