Клеточная машина

К 50-м годам было установлено, что живая клетка представляет собой совершенную «машину» с исключительно сложной структурой, в которой одновременно происходят тысячи реакций разложения и синтеза, разрушения и созидания, благодаря чему поддерживается структура живой материи. Особый вклад в изучение клетки внесли Джордж Эмиль Паладе из Рокфеллеровского института медицинских исследований в Нью-Йорке, Кристиан Рене Де Дюв из того же института и Альбер Клод из Брюссельского университета. Общим в их работе является то, что все они отдавали предпочтение методу дифференциального центрифугирования.

Ультрацентрифугу изобрел Теодор Сведберг для проведения исследований в коллоидной химии. Клеточные гомогенаты, с которыми работают биохимики, также относятся к коллоидным растворам, и многие биологи сразу же стали использовать метод центрифугирования. Однако длительное время не удавалось получить удовлетворительных результатов. Метод дифференциального центрифугирования был создай трудом большого числа ученых, среди которых ведущую роль играл Альбер Клод.

Суть метода проста. Клеточный гомогенат, представляющий собой смесь различных компонентов клетки, подвергается последовательному центрифугированию с увеличением числа оборотов. Таким образом создается искусственная гравитация, под действием которой из коллоидного раствора последовательно осаждаются все более легкие частицы. Ускорение, характеризующее вес частицы, измеряется в единицах «сведберг» и обозначается буквой S. Вначале осаждаются неразрушенные клетки. Жидкость переливается в другой сосуд, и центрифугирование продолжается таким же методом. Далее происходит последовательное выпадение в осадок крупных клеточных фрагментов, ядер, митохондрий, лизосом и рибосом. На каждом этапе А. Клод идентифицировал осаждаемые объекты, наблюдая их под микроскопом. Его исследования подтвердили, что с митохондриями связаны процессы окисления. Проведя биохимические эксперименты, он открыл в составе митохондрий некоторые из дыхательных ферментов.

Дальнейшее развитие метода дифференциального центрифугирования связано с именем Кристиана Де Дюва. Кульминацией его работы явилось открытие в 1963 г. лизосом. Это открытие в известной мере произошло случайно. Де Дюв и его сотрудники исследовали субклеточные фракции клеток печени крысы. Неожиданно в гомогенате было обнаружено резкое усиление ферментативной активности. Исследование этого феномена показало, что клетки имеют особые частицы, в которых содержатся ферменты, способные разлагать различные вещества. Разрыв лизосомы на части приводит к лизису (разрушению клеточных структур или самой клетки) — так в живых системах разрушается старое, чтобы дать место новому. Оказалось, что лизосомы есть практически во всех клетках и что они принимают самое деятельное участие в физиологических и патологических, процессах, происходящих в клетке. Возник самостоятельный раздел клеточной патологии, который занимается изучением дефектов в структуре и функции лизосом.

Выделение фракций, состоящих из все более мелких частиц, потребовало использования электронного микроскопа. С помощью этого прибора больших успехов добился Джордж Паладе. Он подробно изучил митохондрии и рибосомы, описал ультраструктуру митохондрий, в частности гребешки на внутренней мембране, названные его именем. Многие годы рибосомы, подробно исследованные им, назывались также «гранулами Паладе». Используя ультрацентрифугу, он выделял субклеточные частицы, после чего искал их в структуре самой клетки, чтобы увидеть эти частицы в первоначальном виде и установить их взаимодействие с другими клеточными органеллами,

Альбер Клод сделал свои крупные открытия еще в 40-е годы. Наиболее активный период в деятельности Паладе и Де Дюва приходится на 50-е. годы. В 1974 г. — с заметным опозданием — трое названные ученых были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине. Такая высокая оценка их труда Нобелевским комитетом при Каролинском институте была продиктована большой важностью исследований клетки, заменивших ныне классический биохимический эксперимент с гомогенными растворами. Эти исследования — свидетельство постепенного объединения биохимии с цитологией на уровне молекулярной биологии, когда химический состав и биологическая структура изучаются в комплексе. Именно в таком направлении видится, будущее развитие науки о жизни.

В истории физиологии отчетливо прослеживается постепенный переход от исследований животных как целого к исследованиям тканей и экстрактов из них. С одной стороны, это позволило детально изучить процессы обмена веществ, а с другой — привело к потере связи между структурой и функцией. Лишь в 50—60-е годы, с развитием современных методов исследования, физиологию клетки начали связывать с функциями субклеточных структур. Особенно большие успехи были достигнуты в изучении синтеза белковых веществ, осуществляемого в рибосомах по команде ДНК с помощью различных видов РНК. Теперь предстоит установить, где именно в клетке возникают и другие химические вещества. В настоящее время более значительных успехов удалось добиться в изучении их синтеза.

В то время как процесс разложения углеводов исследован сравнительно давно, их синтез долгое время оставался неразгаданным. Многие видные ученые допускали, что указанные реакции обратимы и сахара создаются так же, как и разлагаются. Лишь в 1949 г. аргентинский ученый Луис Федерико Лелуар, ученик Бернардо Усая, сделал открытие, которое в корне изменило направление мыслей биохимиков. Он установил, что превращение моносахаридов из одного вида в другой происходит в присутствии какого-то неизвестного вещества. Выделив это вещество, Лелуар определил его химическую структуру. Оно представляло собой фрагмент углевода, связанный с нуклеотидом. Исследования аргентинского ученого показали, что трансформация моносахаридов происходит после их соединения с подобным нуклеотидом. Это делает их активными и реакцию возможной. Далее выяснилось, что с помощью нуклеотидов осуществляется биосинтез таких полисахаридов, как гликоген, крахмал, целлюлоза и т. д.

Эта идея имела большое значение для биохимии. Ученые отказались от представлений об обратимом характере этих реакций. Выяснилось, что разложение и синтез идут разными путями. Впоследствии было установлено, что это относится и к другим группам соединений, в частности к белкам и нуклеиновым кислотам.

Л. Лелуар специализировался в 1936 г. по биохимии у Ф.Г. Хопкинса в Кембридже, в 1944 г. был ассистентом Карла Кори, а затем Бернардо Усая в Буэнос-Айресе. Восприняв опыт этих крупных ученых, он сумел внести свой собственный большой вклад в биохимию, что и принесло ему в 1970 г. Нобелевскую премию по химии.

Важное место в учении о метаболизме занимает исследование жирных кислот и других соединений, образующих большую группу липидов. Особый интерес представляют стерины, к которым относятся многие физиологически активные соединения. Химическая структура этих соединений начала выясняться в начале XX в.; в 1928 г. Генрих Виланд и Адольф Виндаус (Виланду премия была присуждена за 1927 г.) получили Нобелевскую премию по химии за исследования структуры соответственно желчных кислот и холестерина. Было установлено, что у животных и растений имеется большое число стеринов, например витамин D, половые гормоны, гормоны надпочечников и т. д. Некоторые из них были известны довольно давно. Холестерин был открыт еще 200 лет назад в желчных камнях. Однако детали механизма синтеза стеринов начали выясняться лишь после того, как Конрад Эмиль Блох и Феодор Линен применили для изучения цепи биохимических реакций- метод меченых атомов.

Исследования этих ученых заложили основы современных представлений о динамике процессов в живых клетках. Фундаментальным открытием — оно было сделано в лаборатории Рудольфа Шёнхеймера в Колумбийском университете — явилось выяснение роли уксусной кислоты как структурного элемента при синтезе холестерина и жирных кислот. Эти исследования в основном выполнены Блохом. В то же самое время Линен в Мюнхенской лаборатории Генриха Виланда (его тестя) также изучал метаболизм уксусной кислоты и открыл ее активированное состояние, которое оказалось предшественником всех липидов человеческого организма. Этот активированный ацетат образуется в ряде процессов обмена веществ.

Работы Блоха и его сотрудников позволили выяснить, как из двууглеродной ацетатной группы получаются длинные молекулы с 30 атомами углерода. Была определена последовательность родственных соединений, близких в химическом отношении, но довольно далеких друг от друга в физиологическом плане. Оказалось, что они имеют общее происхождение и представляют собой просто этапы в цепи биосинтезов. Например, ланостерин выделяется из шерсти овец, а родственный ему холестерин широко распространен в крови и тканях человека. В свою очередь холестерин является предшественником желчных кислот некоторых половых гормонов.

Линен, который работал над теми же проблемами, получил аналогичные результаты. Однако наряду с этим он интересовался и клеточным аспектом проблемы, связывая его более тесно с обменом веществ и структурой. Кроме того, Линен показал, как может видоизменяться цепь синтезов, в результате чего вместо стеринов получаются терпены, каучуки и другие вещества. В этих реакциях участвуют и активированные изопреновые молекулы.

Биохимические исследования К. Блоха и Ф. Линена во многом способствовали изучению путей биосинтеза в организме одной биологически очень важной группы соединений. Холестерин давно интересовал медицину, так как его отложение на внутренних стенках кровеносных сосудов ведет к их сужению и закупорке. Проблема снятия этих отложений и поддержания кровеносной системы в должном состоянии все еще остается нерешенной. За исследования обмена холестерина и жирных кислот К. Блох и Ф. Линен были удостоены в 1964 г. Нобелевской премии по физиологии и медицине.

Химия клетки ведет свое начало с середины прошлого века. Одно из первых ее достижений — открытие нуклеиновых кислот. Как говорит само их название, эти кислоты связаны с ядром клетки. Они были открыты в 1869 г. Фридрихом Мишером. Сам он использовал термин «нуклеин», и лишь 20 лет спустя немецкий биохимик Р.Альтман ввел понятие нуклеиновой кислоты.

Свои открытия Мишер сделал, работая в лаборатории известного биохимика Ф. Гоппе-Зейлера. В 1879 г. в этой лаборатории начал исследования нуклеиновых кислот Альбрехт Коссель. Нуклеиновым кислотам и связанным с ними протеинам он посвятил более четверти века. В 80-е годы Коссель, проведя успешные эксперименты по гидролизу нуклеиновых кислот, обнаружил, что они содержат аденин, гуанин, фосфорную кислоту и еще какое-то вещество, подобное сахару. В сущности, он открыл первичную структуру этих сложнейших биополимеров.

В клетке нуклеиновые кислоты тесно связаны с белками, имеющими щелочной характер. Коссель отдал много сил и времени их изучению. Оказалось, что они принадлежат к группе протаминов (которые относятся к простейшим белкам) и гистонов.

Исследования Косселя в биохимии происходили в очень важный для нее период — период ее утверждения как науки. Исследуя такие сложные соединения, как нуклеиновые кислоты и белки, ученый открыл ряд их составных элементов: гипоксантин, аденин, гуанин (являющиеся составными частями нуклеина), а также аминокислотный гистидин. За свои достижения А. Коссель был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине.

В 1936 г. Макс Фердинанд Перуц, молодой австриец, работавший в Кавендишской лаборатории, приступил к исследованию структур гемоглобина методом рентгеноструктурного анализа. Это вещество переносит кислород в кровь и имеет огромное значение для физиологии. Первые рентгенограммы были получены в 1937 г. Объектом исследования служил гемоглобин лошади. Результаты было исключительно трудно интерпретировать, так как они требовали трудоемких вычислений, а ЭВМ тогда еще не существовало. Год за годом Перуц с исключительным терпением продолжал свои эксперименты, поддерживаемый и поощряемый руководителем лаборатории У.Л. Брэггом. В 1953 г. Перуц усовершенствовал метод рентгеноструктурного анализа, что облегчило расшифровку получаемых рентгенограмм. В 1959 г., после более чем двадцатилетней работы, Перуц и его сотрудники смогли наконец продемонстрировать пространственную структуру гемоглобина. В этой работе ему помогали многие ученые. Дж. Бернал научил его, как делать рентгенограммы, а Д. Кейлин, один из крупнейших английских биохимиков нашего века, обеспечил ему доступ в свою биохимическую лабораторию. Крик, Уотсон и Сенгер, будущие лауреаты Нобелевских премий, работали у Перуца и в свою очередь освоили его опыт.

В 1946 г. из английских военно-воздушных сил был демобилизован специалист, участвовавший в разработке радаров. Джои Кендрю, закончивший Кембриджский университет по специальности химика, вернувшись в этот научный центр, начал работать у Перуца. Под влиянием Бернала и Полинга он заинтересовался структурой белков и решил избрать объектом своих исследований небольшую белковую молекулу — миоглобин. Это вещество, родственное гемоглобину, содержится в мышцах. Его молекула, в 4 раза меньшая, чем у гемоглобина, служит своеобразным накопителем для кислорода. Наличием миоглобина объясняется красный цвет мышц. Особенно много миоглобина у морских млекопитающих, которые длительное время остаются под водой и потому нуждаются в большом запасе кислорода в тканях тела; из-за большого содержания миоглобина их мышцы имеют очень тёмный цвет.

Кендрю и его сотрудники, извлекали миоглобин из мяса кашалота и для получения контрастных рентгенограмм обрабатывали его ртутью или золотом. Так как миоглобин имеет сравнительно простую структуру, эта группа довольно быстро добилась успеха — в 1957 г. пространственная структура миоглобина была определена.

В 1962 г. Нобелевские комитеты по химии и по физиологии и медицине приняли решение о присуждении премий ученым, добившимся успехов в определении структуры гигантских биомолекул. Премии по физиологии и медицине были удостоены Фрэнсис Крик, Джеймс Уотсон и Морис Уилкинс за определение пространственной структуры ДНК. Лауреатами премии по химии стали Перуц и Кендрю, открывшие структуру гемоглобина и миоглобина.

Все эти исследования проводились методом рентгено-структурного анализа, а для обработки результатов использовались первые, еще несовершенные ЭВМ. Сейчас в распоряжении исследователей имеется значительно более совершенная техника, которая дает возможность значительно ускорить исследование структуры биомолекул. В 1967 г. Д. Филипс определил структуру лизоцима. В те же 60-е годы Уильям Хоуард Стайн, Станфорд Мур и Кристиан Бемер Анфинсен установили структуру рибонуклеазы, за что были удостоены в 1972 г. Нобелевской премии по химии. Процесс этот — чрезвычайно медленный, но только через него можно перейти от молекулярных структур к молекулярным комплексам и клеточным субструктурам и объяснить строение живого существа во взаимосвязи с его функцией. Это одна из важнейших задач биологии будущего.

Дальнейший прогресс в исследовании молекулярных комплексов клетки был достигнут благодаря работам Арона Клуга из Лаборатории молекулярной биологии Медицинского исследовательского центра в Кембридже. Клуг сочетал метод рентгеноструктурного анализа с электронной микроскопией.

Клуг начал работать в Кембридже в 1949 г., здесь он обучился искусству получения рентгенограмм у Розалинд Франклин, внесшей большой вклад в определение структуры ДНК. Желая установить, как нуклеиновая кислота связывается с протеиновыми молекулами, Клуг начал с исследования вируса табачной мозаики. Накопленный при этом опыт оказал ему неоценимую помощь впоследствии, когда ученый стал заниматься хромосомами человека. В частности, он интересовался хроматином, составляющим основу хромосом. Во время деления клетки, когда ДНК хромосом находится в деспирализованном состоянии, хроматин различим в микроскоп. Нуклеопротеиновая структура хромосом очень напоминает вирусы, которыми Клуг уже занимался, что и позволило ему добиться в этой области значительных успехов.

Еще в 1968 г. Клуг применил метод ренгеноструктурного анализа в сочетании с математической обработкой данных на ЭВМ. Впоследствии он освоил электронную микроскопию, повысив разрешающую способность метода до 2,8 ? (ангстрем; напомним, что диаметр атома водорода равен 1 ?). При этом Клуг получал изображения, не пользуясь такими контрастными веществами, как, например, атомы тяжелых металлов.

При столь высокой разрешающей способности удается получить изображения большинства атомов химических элементов. Таким образом химик имеет возможность наблюдать непосредственно молекулы и их комплексы. Вероятно, тайная мечта «увидеть» химическую реакцию волновала почти каждого исследователя, занимавшегося данной областью науки. Арон Клуг, вплотную приблизившийся к этой заветной цели, был удостоен в 1982 г. Нобелевской премии по химии. Его исследования хроматина пролили луч света на тончайшую структуру генетического аппарата. Это, несомненно, ускорит исследования функции генов и, возможно, сыграет решающую роль в выяснении природы рака и других заболеваний. Рассматривая микромир в электронный микроскоп, специалисты по молекулярной биологии смогут лучше понять,как работает клеточная машина.