Биоэнергетика

В начале нынешнего столетия шведский исследователь Магнус Блике, используя термоэлектрический эффект, создал прецизионную аппаратуру для измерения количества тепла, выделяемого живым организмом. Позднее она была усовершенствована английским ученым Арчибалдом Вивиеиом Хиллом из Кембриджского университета. Его термогальванометр измерял изменения в температуре порядка ¹/₁₀₀₀ ?C за сотую долю секунды. С помощью этого прибора удалось открыть интересные биохимические процессы, происходящие при сокращении мышц.

Хилл установил, что при самом сокращении выделяется только та часть тепла, которая сопровождает реакции превращения химической энергии в организме. Остальное количество тепла (оно может составлять более половины) выделяется через несколько минут. Все это тепло возникает в результате работы мышцы как термодинамической машины, к. п. д. которой достигает приблизительно 20—30%, а остальная часть тепловой энергии рассеивается.

Английский исследователь изучал также закономерности сокращения мышц в зависимости от их питания кислородом. Оказалось, что на первой стадии сокращения кислород не нужен, тогда как на второй от него зависит, будет выделяться дополнительное тепло или нет. Выяснение этих закономерностей, связанных с фазами действия и восстановления в работе мышц, оказалось очень полезным для биохимиков, так как открывало путь для исследования биоэнергетических реакций и интерпретации данных. Эти результаты способствовали лучшему пониманию термодинамики мышц и позволили конкретно исследовать работу этих «живых машин».

В 1859 г. немецкий ученый Эмиль Генрих Дюбуа-Реймон обнаружил в мышечной ткани молочную кислоту. Незадолго до этого он получил от Берцелиуса письмо, в котором шведский коллега сообщал о том, что молочная кислота была обнаружена в мясе оленя, убитого после длительного преследования. Эти первые наблюдения заложили основу исследования биохимических процессов, связанных с дыханием и выделением энергии.

В начале нашего столетия было уже точно известно, что при работе мышцы в ней накапливается молочная кислота, которая при бездействии мышцы окисляется. Считалось, что это какой-то побочный продукт, образующийся при работе мышечных клеток. Лишь количественные исследования немецкого ученого Отто Мейергофа внесли некоторую ясность в этот вопрос. Прежде всего он показал, что на стадии покоя окисляется не более одной трети молочной кислоты. Затем Мейергоф установил, что часть молочной кислоты восстанавливается, образуя полисахаридный гликоген, который подобен крахмалу и играет в клетках животных роль «депо энергии».

Таким образом, картина начала проясняться. На первой стадии сокращения мышцы обнаруженное Хиллом выделение тепла, как это установил Мейергоф, происходит в результате разложения гликогена на моносахарид и молочную кислоту. При этом химическая энергия превращается в механическую. На второй стадии, когда мышца бездействует, молочная кислота частично окисляется, а частично восстанавливается до гликогена. В 1922 г. Мейергоф и Хилл за свои исследования термодинамики мышечной деятельности и механизма мышечного сокращения были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине.

В нормальных условиях глюкоза и кислород не вступают в реакцию, однако в присутствии подходящих ферментов сахар довольно активно окисляется, превращаясь в двуокись углерода и воду. Изучение таких биокатализаторов является одним из крупных достижений известного биохимика Отто Генриха Варбурга, работавшего в Гейдельберге и в Институте физиологии клетки в Берлине (Далем). Поскольку ферменты обычно встречаются в ничтожно малых количествах, Варбург исследовал их косвенными методами, преимущественно с использованием спектроскопии.

Еще в 80-е годы прошлого века Чарлз Макманн методом спектроскопии обнаружил в некоторых тканях неизвестное вещество, которое поглощало кислород и. имело такие же спектральные линии, как и гемоглобин. Отсюда был сделан вывод, что в тканях содержится какой-то фермент, похожий на гемоглобин. Значение этого открытия стало понятным лишь в 20-е годы, когда Варбург стал заниматься исследованием клеточного дыхания. Он вновь применил спектроскопию и вторично установил сходство катализаторов биологического окисления с гемоглобином. На основании этого Варбург сделал вывод, что дыхательный фермент в своей белковой молекуле также имеет порфириновое ядро с одним атомом железа, который взаимодействует с кислородом.

Эти дыхательные ферменты, обнаруженные по их спектру, были названы цитохромами[22]. За объяснение механизма клеточного дыхания действием ферментов Варбург был удостоен в 1931 г. Нобелевской премии по физиологии и медицине. Продолжая работать в этой области, Варбург в следующем году вместе со своим сотрудником Вальтером Кристианом открыл новый дыхательный фермент желтого цвета, который был назван флавином. Оказалось, что это представитель большой группы флавинов (ферментов биологического окисления, образующих вместе с цитохромами дыхательную цепь).

В том же 1932 г. венгерский биохимик Альберт Сент-Дьёрдьи приступил к исследованию «желтых» ферментов в своей лаборатории в Сегеде. В отличие от большинства ученых, которые занимались исследованием окислительных процессов, он сосредоточил свое внимание на ферментах, которые активировали водород и переносили его в клетках. На работу Сент-Дьёрдьи большое влияние оказали наблюдения Генриха Виланда, касающиеся воздействия палладия на некоторые органические вещества. Виланд установил, что, вступая в контакт с этим металлом, органические соединения теряют водород, а это равносильно частичному окислению. Это произвело на биохимиков большое впечатление, и они занялись поисками ферментов, оказывающих подобное действие. Вскоре были открыты дегидрогеназы, катализирующие отщепление водорода от молекул[23].

Постепенно из отдельных наблюдений формировалось единое представление о дыхательных ферментах. По линии цитохромов движутся электроны, обеспечивающие активацию кислорода, а с другого направления дегидрогеназы поставляют водород. Так происходит ступенчатое окисление веществ до воды и углекислоты и постепенное выделение энергии. Эти исследования показали взаимосвязь между ферментами и витаминами. Составной частью «желтых» ферментов оказался рибофлавин (витамин В₂). Это открытие было сделано Рихардом Куном и Паулем Каррером. Сам Сент-Дьёрдьи занялся исследованием красного стручкового перца, который всегда производился в большом количестве около Сегеда, н обнаружил, что знаменитая венгерская паприка очень богата витамином С. Оказалось, что этот витамин также участвует в процессах переноса водорода.

Обычно исследования биохимических реакций проводятся в гомогенной массе, получаемой путем растирания в порошок живых тканей. Проводя такие опыты над гомогенатом мышечной ткани, некоторые ученые, в том числе Сент-Дьёрдьи, обнаружили, что при добавлении янтарной, фумаровой, яблочной и щавелево-уксусной кислот окислительные процессы усиливаются. Почти одновременно в начале 30-х годов шведский химик Тор-стен Людвиг Тунберг открыл ферменты, являющиеся дегидрогеназами названных кислот. Стало ясно, что эти кислоты, оказывая определенное каталитическое действие, служат звеньями в цепи окислительных процессов, при которых происходит выделение энергии. В этих открытиях решающая заслуга принадлежит Альберту Сент-Дьёрдьи, получившему в 1937 г. Нобелевскую премию по медицине и физиологии за исследования процессов биологического окисления, а также за выделение в кристаллическом виде витамина С.

Вскоре после этого английский биохимик Ханс Адольф Кребс установил, что «эффект Сент-Дьёрдьи», наблюдаемый при добавлении фумаровой кислоты к гомогенату клетки, можно получить и с помощью двух других органических кислот (кетоглутаровой и пировиноградной). Поначалу это только внесло еще большую путаницу в реакции, которые не могли объяснить биохимики. Однако Кребс первым из биохимиков догадался, что все эти органические кислоты составляют звенья одной цепи окисления органических веществ до двуокиси углерода и воды. Он предложил схему, описывающую процесс постепенного окисления органических веществ.

Вначале к щавелевоуксусной кислоте добавляется какое-то соединение с двумя атомами углерода и образуется трикарбоновая кислота, которая под действием различных ферментов превращается в другие, подобные ей органические кислоты. На каждой стадии происходит выделение воды, водорода или двуокиси углерода, причем энергия активированного водорода включается в макроэргические связи аденозинтрифосфата (АТФ) — универсального аккумулятора энергии в живых организмах. Кребс, предложивший цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса) в 1937 г., поначалу подвергся резкой критике. Однако постепенно ученые оценили эту идею, которая внесла упорядоченность в представление о цепи реакций аэробного окисления.

Но, к немалому огорчению биохимиков, одно звено в этой цепи оставалось неизвестным: было не ясно, какое соединение с двумя атомами углерода вводится в цикл Кребса. Этим вопросом занялся Фриц Альберт Липман, работавший в свое время в Институте физиологии клетки в Берлине (Далем), а с 1939 г. — в Медицинской школе Корнеллского университета (шт. Нью-Йорк). Он продолжал развивать теорию, согласно которой этим соединением является ацетилфосфат, но такое предположение не увязалось с экспериментальными данными, и ученые стали все больше сомневаться в справедливости этой хорошей теории. Но именно в то время, когда большинство исследователей были готовы вообще отказаться от этой идеи, Липман с сотрудниками открыли вещество, отличающееся высокой термостойкостью и имеющее сравнительно небольшую молекулярную массу. Это говорило о том, что данное вещество является коферментом. Он был обозначен буквой А.

Кофермент А и оказался тем недостающим звеном в цепи реакций биологического окисления, которое столь долго и тщетно искали ученые. По своей структуре он близок к витаминам группы В. Его функция в цикле Кребса — «улавливать» ацетиловый остаток пировиноградной кислоты и вызывать его соединение с щавелевоуксусной кислотой, приводящее к образованию трикарбоновой кислоты — первое звено цикла. Далее происходят уже описанные процессы медленного окисления, в ходе которых из первоначального углеродного скелета пировиноградной кислоты образуются три молекулы двуокиси углерода и пять пар двойных активированных атомов водорода, несущих в себе энергию, необходимую для организма. В конце цикла вновь образуется щавелевоуксусная кислота, в которую кофермент А подает новую молекулу пировиноградной кислоты. Так работает этот «конвейер», который в соответствии с потребностями организма создает богатые энергией вещества или соединения, необходимые для образования макромолекул. Решающая заслуга в открытии цикла аэробного окисления в организме принадлежит X. Кребсу и Ф. Липману. За свои достижения оба они были удостоены в 1953 г. Нобелевской премии по медицине и физиологии.

Пировиноградная кислота, участвующая в цикле Кребса, образуется в результате гликолиза — анаэробного расщепления углеводов. В этом процессе фосфорилирования молекула глюкозы соединяется с фосфорной кислотой и затем расщепляется на две. Из шестиатомного кольца получаются два соединения с тремя атомами углерода, которые после различных преобразований приводят к образованию пировиноградной кислоты. Если эта кислота не включается в цикл Кребса, то из нее образуются молочная кислота или другие вещества. Большая заслуга Кребса состоит в том, что он сумел связать воедино все эти цепи.

В организме имеется несколько различных аккумуляторов энергии. Наряду с АТФ, поставляющим энергию на «непосредственные нужды» организма, происходит ее накопление «про запас», на более длительный период, в жировых тканях. Источником энергии служат также полисахариды: близкие по структуре крахмал (в растениях) и гликоген (у животных). Это биополимеры, состоящие из большого числа молекул глюкозы. Процесс разложения гликогена детально исследовали супруги Карл Фердинанд и Герти Тереза Кори, которые, кроме того, открыли ферменты, служащие катализаторами при реакциях разложения и синтеза. Они установили, что молекулы глюкозы в процессе фосфорилирования отщепляются. Полученный глюкозофосфат включается в цепь анаэробного разложения, что приводит к образованию пировиноградной кислоты и циклу Кребса.

За исследования в области обмена углеводов у животных и открытие связанных с ним ферментов супруги Кори были удостоены в 1947 г. Нобелевской премии по медицине и физиологии. Вместе с ними был награжден и аргентинский ученый Бернардо Усай, занимавшийся изучением роли гормонов в регуляции углеводного обмена.

Все эти реакции происходят только. благодаря соответствующим ферментам. Об этом говорил еще великий Йене Берцелиус в XIX в. Случилось так, что его соотечественник, закончивший то же самое училище в Линчёпинге 124 года спустя, получил конкретные данные, подтверждающие мысли своего знаменитого предшественника. Это был Аксель Хуго Теодор Теорелль, руководитель отдела биохимий Нобелевского медицинского института. В 1955 г. профессора Каролинского института с особым удовольствием вручили премию по медицине и физиологии своему коллеге — за крупные достижения в исследовании природы и механизма действия окислительно-восстановительных ферментов. О. Варбург называл своего способного ученика Теорелля мастером исследования ферментов.

Исследования Теорелля связаны с цитохромами и флавопротеидами. Цитохромы активируют кислород, в то время как флавопротеиды, являющиеся дегидрогеназами, переносят водород. В конце процесса окисления эти два элемента соединяются, образуя воду.

В 30-е годы советские биохимики Владимир Александрович Энгельгардт и Владимир Александрович Белицер показали, что накопление полезной энергии в клетке является результатом двух реакций. При первой вещества, содержащиеся в пище, окисляются, выделяя энергию.

Одновременно с этим происходит синтез аденозинтрифосфорной кислоты, при котором идет поглощение энергии. Полученный аденозинтрифосфат (АТФ) обладает замечательным свойством: он легко переносится в организме и выделяет энергию там, где это необходимо. АТФ решает энергетические проблемы организма, связанные как с переносом, так и с аккумуляцией энергии.

В 1949 г. американский биохимик Альберт Лестер Леиинджер связал эти результаты с данными цитологии. Он показал, что окислительное фосфорилирование осуществляется в митохондриях, клеточных образованиях удлиненной формы, которые отделены мембраной от клеточной плазмы. В начале 60-х годов стало ясно, что на внутренней стороне митохондриалыюй мембраны находятся дыхательные ферменты. В это время сотрудник кафедры зоологии Эдинбургского университета опубликовал в журнале Nature небольшую статью, где высказал свои соображения о значении мембран для рассмотренных биохимических реакций. Это был Питер Митчелл. Вскоре после публикации статьи он ушел из университета, чтобы начать самостоятельные исследования.

В 1966 г. Митчелл, руководя собственной лабораторией, в штате которой числился всего один сотрудник, вновь обратился к фундаментальным исследованиям. Обнаружив, что на опубликованную им в 1961 г. статью никто не обратил внимания, он решил изложить свои взгляды подробно и написал книгу. В ней он развивал теорию, согласно которой химическая энергия, выделяющаяся при окислении в митохондриях, превращается сначала в электрическую энергию, создающую мембранный потенциал. Затем электрическая энергия вновь превращается в химическую — на этот раз в форме АТФ. Эти представления сформулированы в так называемой хемиосмотической теории окислительного фосфорилирования.

К сожалению, ни один издатель не взялся напечатать книгу Митчелла. Тогда автор сам размножил рукопись и разослал ее биохимикам всего мира. В ответ со всех сторон раздалась ожесточенная критика. Время, однако, работало на Митчелла. Детальные исследования, проведенные самыми различными методами, позволили раскрыть тонкую структуру митохондриальной мембраны и подтвердили, что в ней находится цепь ферментов — переносчиков электронов. В других экспериментах были непосредственно измерены разность потенциалов на внешней и внутренней стенках мембран и проходящий через нее электрический ток. Оригинальная идея Митчелла подтвердилась[24]. Он заставил биохимиков думать по-новому: стало понятным, что недостаточно знать только последовательность биохимических реакций — необходимо исследовать и их пространственную организацию.

Этот одинокий исследователь с единственной сотрудницей, вероятно, вызвал бы особенное восхищение Альфреда Нобеля, который также всегда был одинок в своих поисках. Но идеи Митчелла в конце концов восторжествовали. За свою хемиосмотическую теорию, которая вывела биоэнергетику на новый рубеж, П. Митчелл был удостоен в 1978 г. Нобелевской премии по химии. Денежное вознаграждение и пришедшая вслед за присуждением премии слава весьма благоприятно отразились на его маленькой лаборатории.